英文题目：Dynamic characterization of volatile and non-volatile profiles during Toona sinensis microgreens growth in combination with chemometrics
中文题目：结合化学计量学对香椿苗生长过程中挥发性与非挥发性代谢物的动态特征分析
期刊名称：Food Research International
影响因子：8.0
作者单位：西北农林科技大学
DOI：https://doi.org/10.1016/j.foodres.2025.116013
研究背景
香椿以其美味的嫩芽作为季节性美食而闻名，在中国，食用香椿芽（TSB）的历史已有数千年。许多研究已经证实了香椿芽的多种营养成分（丰富的氨基酸和维生素）和多种生理功能（抗炎、抗糖尿病和抗菌活性）。然而，作为一种季节性蔬菜，香椿芽在谷雨节气之后往往会迅速木质化。因此，尽管香椿在中国广泛种植，但其市场供应常常无法满足消费者的需求。香椿的广泛种植导致种子大量积压，存在资源浪费的风险。随着农业现代化的发展，香椿苗是减少种子浪费并提供新鲜、类似香椿蔬菜的完美解决方案。
香椿苗（TSM）因其香气与香椿芽（TSB）相似而广受欢迎，但其生长过程中代谢物动态变化及调控机制尚不明确。本研究通过顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用（HS-SPME-GC/MS）和超高效液相色谱-电喷雾串联质谱（UPLC-ESI-MS/MS）技术，解析TSM四个生长阶段的代谢特征，旨在为优化其栽培和功能开发提供依据。
研究路线
研究结果
01挥发性代谢物分布
（1）香椿苗样品香气类别的概述
研究采用顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用（HS-SPME-GC-MS），对香椿苗（TSM）样品的挥发性有机物进行定性定量分析。共鉴定出82种挥发性有机物，包括43种萜类化合物、30种挥发性硫化物（VSCs）、2种醛类、1种酮类、1种酯类及5种其他化合物。随着TSM生长阶段的推进，总挥发性有机物（VOCs）含量呈现逐步增加趋势（图1B）。所有TSM样品中均以含硫化合物（VSCs）为主导香气类别，占总VOC的71%-81%（图1B）。值得注意的是，VSCs含量在M1到M2、M3到M4阶段呈现快速上升趋势，其中M4阶段的VSCs总量是M1阶段的两倍有余。此外，萜类化合物在M2和M3阶段含量最高且最为丰富。酯类及其他化合物在M2阶段含量达到峰值后逐渐下降。所有样品仅检出两种C-6醛类化合物，但其变化趋势与总挥发性有机物含量呈现相反规律—随生长进程逐渐减少。
（2）不同生长阶段香椿苗中关键差异挥发性有机物的分析
为比较各生长阶段的整体挥发性有机物含量，基于HS-SPME-GC-MS数据集进行了主成分分析（PCA）（图1C）。前两个主成分解释了80.0%的变异，显示出良好的生长阶段区分能力，但M2和M3除外。因此进一步采用偏最小二乘判别分析（PLS-DA，图1D）来探索挥发性有机化合物（VOC）谱的特征。通过使用变量重要性投影值（VIP）>1.0且p<0.05作为筛选条件，成功鉴定出四个生长阶段样本的19种差异挥发性有机物，包括8种硫代羧酸（VSCs）、7种萜类化合物、1种醛类、1种酮类、1种酯类及1种其他化合物。如图1E所示，PLS-DA载荷图揭示了样本与挥发性有机物之间的关联关系。总体而言，M1含有较高浓度的绿叶挥发物（GLV）/脂质衍生物，其中与绿叶气味相关的醛类（Ald-1）尤为显著。M2和M3表现出较高含量的萜类化合物，这些化合物与甜味（Ter-10）、柑橘类（Ter-12）、琥珀香型（Ter-23）、草本及花香型（Ter-33）香气相关。同时，M4样本富含硫代羧酸，可能与某些典型硫磺香气相关。
图1F展示了绿色植株发育过程中关键差异挥发性有机物的相对含量及VIP值。其中，VSCs的VIP值显著高于萜类化合物。值得注意的是，Sul-18是含量最高的挥发性有机化合物（VOC），其VIP值最高（VIP=3.24）。经过数日生长后，M4样本中的Sul-18含量较M1样本高出2.43倍。此外，Sul-18的异构体Sul-14也表现出较高VIP值（VIP=2.18），这两种异构体的总含量占所有样本VOC总量的35.81%-43.06%。同时，Sul-18的气味阈值较低（OT=0.039μg/kg），其气味活性值（OAVs）介于4557-11,090之间，这表明它不仅对TSM样品的整体香气贡献显著，还参与了四个生长阶段的差异性香气形成。
噻吩不仅赋予独特风味，还作为已充分研究的骨架结构，用于开发具有潜在抗癌特性的分子库。因此，高含量的噻吩可能是TSM应用的另一优势。除三硫化物（硫-24和硫-25）外，所有VSCs在M4中的浓度最高。一方面VSCs具有亚硫酸盐香气且是多种香料蔬菜的关键成分；另一方面，过量的硫化物会产生刺鼻刺激性气味，可能影响消费者的饮食习惯。对于TSM，尤其是M4阶段而言，平衡整体香气与其他挥发性有机物至关重要。与这些挥发性硫化物（VSCs）相比，Sul-13（3-（甲硫基）丙酸乙酯）这种硫酯类化合物在菠萝等水果中更为常见，其香气更偏向甜美的果香而非硫磺味。Sul-13在中和其他VSCs引发的刺激性气味方面发挥了积极作用。除VSCs外，还有大量萜类化合物与少量酮类、1种酯类及1种其他化合物共同展现出超过1的VIP值，呈现出甜味（Ter-10）、柑橘类（Ter-12）、琥珀香调（Ter-23）、草本花香（Ter-33和Est）以及青草（Ald-1）等香气特征。然而，其浓度变化趋势与大多数VSCs相反—M1、M2或M3组的含量相对较高（图1F）。特例是Ter-4（β-环柠檬醛）和Ter-23（α-塞林烯），如图1F所示，它们在M4组中含量最高。此外，Ter-4较低的嗅觉阈值使其具有显著的气味活性值（OAVs），范围从368到2357，突显了其在塑造TSM香气中的关键作用。因此，Ter-4、Ter-23和Sul-13在平衡M4组中由强烈气味引发的VSCs方面发挥了重要作用。
图1.（A）不同生长阶段的TSM表型分析；（B）各类别的总挥发性有机物含量；（C）样本的主成分分析（PCA）；（D）偏最小二乘判别分析（PLS-DA）；（E）通过PLS-DA进行的双标图分析；（F）通过PLS-DA筛选出的差异挥发性有机物含量及其变量重要性投影值（VIP）。M1（萌芽期TSM）；M2（顶端钩展开期TSM）；M3（子叶展开期TSM）；M4（子叶完全伸展期TSM）。其中：硫化合物（Sul）；萜类化合物（Ter）；其他化合物（Oth）；酯类（Est）；酮类（Ket）；醛类（Ald）。
02非挥发性代谢物分布
（1）香椿苗中非挥发性代谢物分析
研究通过超高效液相色谱-串联质谱联用技术（UPLC-MS/MS），在四个生长阶段的TSM样本中共检测到888种代谢物。鉴定出的代谢物涵盖11大类：脂质148种（占比16.67%）、酚酸135种（占比15.20%）、氨基酸及其衍生物128种（占比14.47%）、黄酮类化合物85种（占比9.57%）、有机酸83种（占比9.35%）、生物碱68种（占比7.66%）、萜类化合物62种（占比6.98%）、核苷酸及其衍生物49种（占比5.52%）、木脂素和香豆素32种（占比3.60%）、醌类6种（占比0.68%）以及92种其他化合物（占比10.36%）（见图2A）。基于这些代谢物特征，主成分分析模型（PCA）如图2B所示，能有效区分四个生长阶段的TSM样本与质控样品。其中第一主成分（PC1）解释率44.38%，第二主成分（PC2）解释率为18.41%，表明这四组样本间的非挥发性代谢物存在显著差异。
（2）香椿苗生长过程中非挥发性代谢物的动态变化
热图（图2C）直观呈现了TSM生长期间各类非挥发性代谢物的动态变化。总体而言，除萜类、木脂素、香豆素及其他化合物外，大多数非挥发性代谢物在M4阶段含量显著升高。但这些物质的含量并未随TSM生长呈递增趋势。为降低数据维度并提高模型可解释性和有效性，对四个生长阶段进行了PLS-DA模型评估。如图2D所示，不同生长阶段的样本被清晰区分，模型参数表现优异。随后，筛选出差异代谢物（DAMs），各组上调或下调代谢物的具体数量详见火山图（图3A-C）。在416种DAMs中，脂质（81）、酚酸（73）、氨基酸及其衍生物（61）和类黄酮（53）是最多样化的，这表明这些化合物在TSM的生长和发育中起着至关重要的作用。
为明确TSM植株生长过程中DAMs的关键代谢通路，对KEGG进行了富集分析，图3D-F展示了前二十个显著代谢通路。其中，α-亚麻酸代谢、不饱和脂肪酸生物合成、半胱氨酸与甲硫氨酸代谢、组氨酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸及谷氨酸代谢以及色氨酸代谢均与初级代谢中的脂质和氨基酸合成代谢相关。此外，黄酮类化合物的生物合成和苯丙烷类化合物的生物合成在各组中均呈现显著富集，与次级代谢中的黄酮类化合物和酚酸代谢密切相关。显著的富集途径涵盖了对TSM生长发育至关重要的所有四类化合物。因此，在后续分析中研究进一步研究TSM生长过程中脂质、芳香族氨基酸、酚酸和黄酮类物质的变化。
图2.（A）非挥发性代谢物分类统计；（B）M1-M4样本的主成分分析；（C）各类非挥发性代谢物相对含量的热图；（D）M1-M4样本的偏最小二乘判别分析。
图3.差异代谢物火山图（A-C）及KEGG富集气泡图（D-F）对比分析（M1vs.M4、M2vs.M4、M3vs.M4）。
（3）香椿苗的脂质种类和含量变化分析
在TSM生长过程中，脂质的主要成分发生了显著变化，该样本包含36种游离脂肪酸（FFAs）、20种溶血磷脂酰胆碱（LPC）、19种溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）、5种甘油酯和1种磷脂酰胆碱（PC）（图4A）。热图显示，从M1到M4各阶段中，大部分FFAs都显著聚集，并呈现显著上调趋势（图4A）。发芽组织中FFAs的大量积累可能是幼苗建立期间脂质分解代谢的结果。KEGG富集分析结果显示，α-亚麻酸代谢及不饱和脂肪酸（UFAs）生物合成显著富集，且与M2相比M4，一系列UFAs（17-羟基亚麻酸、2-十二碳烯二酸、2R-羟基-9Z，12Z，15Z-十八碳三烯酸（2R-HOTrE）、13S-羟基-9Z，11E，15Z-十八碳三烯酸（13（S）-HOTrE）、9-羟基-12-氧代-15（Z）-十八碳烯酸、芥酸、二十碳二烯酸、二十碳烯酸）均呈现上调趋势。亚麻酸代谢作为UFAs代谢的起始步骤，在多种逆境因子响应酶的作用下，可生成关键次级代谢产物，虽然Ald-1和Ald-2含量从M2到M4阶段呈下降趋势，但与UFAs的上调趋势形成鲜明对比。可能的原因是UFA代谢在M2阶段开始更多地转向植物生长或对抗胁迫。这导致了UFA及其下游产物的调控差异。值得注意的是，多不饱和脂肪酸（PUFAs）中的山嵛酸和单不饱和脂肪酸（MUFA）是DAMs中含量最丰富的脂肪酸。在生长过程中，它们的含量分别增加了2.51倍和2.29倍。由此可见，TSM不仅是UFAs的丰富来源，其芽苗生长也可能有助于提高UFA的富集度。除脂肪酸外，磷脂酰胆碱（LPCs）和溶血磷脂酰乙醇胺（LPEs）是维持细胞完整性至关重要的主要磷脂。作为甘油磷脂的降解产物，大多数LPC和LPE的含量在M3到M4阶段呈现轻微下降趋势（图4A）。这种磷脂含量的轻微减少，可能与TSM生长过程中参与甘油磷酸盐降解的酶类调控机制有关。
（4）香椿苗的氨基酸及其衍生物种类和含量变化分析
从M1到M2阶段大多数二肽含量显著增加，而从M2到M3阶段则有所下降，但除4种氨基酸外，其余氨基酸未发生明显变化（图4B）。这类二肽可能具有独特的生理特性并具备健康益处，被称为生物活性肽，二肽作为感官功能食品添加剂的研究热点，因其在风味提升方面发挥着关键作用。值得注意的是，硫磺木香中的含硫氨基酸及其衍生物在热图中呈现聚集分布，在生长过程中逐渐减少。这些代谢物含量与总挥发性硫化物（VSC）含量变化呈负相关，这些氨基酸及其衍生物作为硫源或合成独特香气的中间代谢物。
（5）香椿苗的酚酸种类和含量变化分析
该研究发现，在TSM生长过程中，酚类化合物是第二大丰度代谢物，也是变化最显著的次生代谢产物。值得注意的是，由奎宁酸与特定反式肉桂酸形成的酯类家族在TSM中占据主导地位。此外，超过半数差异性酚类化合物在TSM生长期间呈现上升趋势（图4C），这与萌发过程能提升植物中某些健康保护性植物化学物质（如酚类化合物）浓度的观点一致。值得注意的是，通过KEGG富集分析发现，在M1与M4、M2与M4以及M3与M4的对比中，苯丙烷类生物合成均显著位列十大富集通路。这说明TSM的生长促进了大部分酚酸的积累，而这些酚酸与抗脂肪饮食具有正相关性。
（6）香椿苗的黄酮类化合物种类和含量变化分析
如图4D所示，TSM中黄酮代谢途径的主要成分包括黄酮醇、黄酮类、黄烷酮、黄烷醇、查耳酮及其他黄酮类物质。这些化合物对食品的苦味形成及生物活性具有关键作用。在生长过程中，黄酮类物质的浓度会逐渐升高。在木犀草素苷类化合物中，槲皮素苷类的含量普遍呈现上升趋势，尤其在M1到M2阶段初期尤为明显。但多数槲皮素苷类却是个例外，在M2到M3阶段中期出现小幅下降。尽管不同类别的变化趋势不尽相同，但绝大多数在M4阶段都达到了峰值。在M4阶段发现的主要黄酮类化合物是槲皮素-3-O-芸香糖苷，该成分此前已被证实为香椿中的重要成分。值得注意的是，本研究首次报道了香椿中存在某些木犀草素苷类物质，如木犀草素-7-O-葡萄糖苷（金丝桃苷）、木犀草素-7-O-芸香糖苷和木犀草素-7-O-橙花苷（橙花素）。总之，这些结果表明，TSM（特别是M4阶段收获的）是天然膳食类黄酮更有价值的来源。
图4.（A）M1-M4差异代谢物（DAMs）中脂类；（B）氨基酸及其衍生物；（C）酚酸类和（D）黄酮类的热图分析。
03通过WCNA对不同香椿苗生长阶段的特定代谢物谱进行表征
对不同TSM生长阶段的特异性代谢物谱型分析显示，TSM在生长过程中存在代谢物谱型的变化，但各发育阶段代谢物的具体特征仍不明确。研究基于所有TSM样本的挥发性和非挥发性代谢物数据集构建了WCNA模型（图5A-D），共鉴定出四个正相关模块（图5B）。具体而言，蓝色模块对应M1，绿色和红色模块对应M2，青绿色模块对应M4。M3未发现正相关模块，这可能是因为其代谢物与M2更接近（图5A）。在蓝色模块中，萜类化合物（copaene和τ-cadinol）被鉴定为M1阶段的枢纽挥发性有机物。这两种化合物均属于杜松烷型倍半萜，具有木质与草本香气特征，在多种植物香气中发挥着和谐互补的作用。此外，这些萜类化合物已被证实能完全抑制真菌菌丝生长。同时，2,3-二羟基-3-甲基丁酸、9,10,11-三羟基-12-十八碳烯酸和1-O-咖啡酰-β-D-葡萄糖被鉴定为M1阶段的枢纽非挥发性代谢物。由此可见，木质与草本气味以及潜在生物活性，是TSM在M1阶段的主要特征。在红色模块中，顺式和反式石竹烯（Ter-11和Ter-12）被鉴定为枢纽挥发性有机物，而四种三萜类化合物则是M2阶段的枢纽非挥发性代谢物。显然，该模块内的所有枢纽代谢物均为萜类化合物，且其浓度达到峰值，表明萜类物质在M2阶段开始积累。
此外，三萜类化合物也是M2阶段另一重要的枢纽代谢物群。这四种被归类为萜类内酯的枢纽三萜类化合物，因其潜在的抗肿瘤活性和抗糖尿病特性正日益受到关注。尽管三萜类化合物已被逐步证实为茶树皮和种子中的关键生物活性成分，但本研究首次报道了茶树皮中存在萜类内酯。这些发现表明，M2阶段的茶树皮可能成为开发新型抗肿瘤药物的重要资源。在绿色模块中，唯一的核心代谢物是酯类（10-羟基癸酸甲酯）和三种二肽。值得注意的是，在M2阶段鉴定出的中心挥发性有机物物质（红色和绿色模块）—顺式与反式石竹烯及酯类，已被证实能赋予植物花香与甜香。相较于M4阶段，M2阶段的香椿嫩芽更接近其柔和的芳香特征。此外，从M1到M2阶段二肽化合物的富集程度显著提升了蔬菜的风味。
由此可见，若以食品消费的风味偏好为考量，M2阶段更能满足消费者的感官期待。在青绿色模块中，三种挥发性硫化物（VSCs，即1,2-二（3-丁烯-1-基）二硫烷Sul-11）、甲基1-（1-丙烯硫基）丙基二硫化物Sul-27、1-（1-丙烯硫基）丙基丙基二硫化物Sul-30）以及一种倍半萜烯（α-塞林烯）被确认为核心挥发性有机物物质。M4菌株中所有核心挥发性硫化物（VSC）均含有支链丙烯基结构的硫化物，这是香椿VSC生物合成前体的关键特征。经筛选，O-乙酰丝氨酸、3-烯丙基亚磺酰基-L-丙氨酸、γ-氨基丁酸和5’-脱氧-5’-（甲硫基）腺苷被确定为M4的核心非挥发性代谢物。大多数VSC是通过蒜氨酸酶催化S-烷基（烯）半胱氨酸亚砜（ACSOs，如Alliin）中间代谢物的自发反应生成的。ACSOs的来源可追溯至谷胱甘肽经半胱氨酸和甲基丙烯酸通过缬氨酸降解产生的S-氧化和去谷氨酰胺化过程。为深入解析turquoise模块（蓝绿色模块）中代谢物富集的关键代谢通路，研究采用MetaboAnalyst 6.0软件基于KEGG通路分析进行富集分析，筛选出与turquoise模块VSCs调控相关的代谢通路，包括半胱氨酸和甲硫氨酸代谢以及谷胱甘肽代谢。在半胱氨酸和甲硫氨酸代谢中，两种关键代谢物—O-乙酰丝氨酸和5’-脱氧-5’-（甲硫基）腺苷—也被确认为枢纽代谢物。如图5E所示，5’-脱氧-5’-（甲硫基）腺苷是唯一与turquoise模块和M4呈现负相关性的枢纽代谢物。M4阶段该代谢物水平的降低表明，甲硫氨酸补救途径中的硫循环效率下降，导致更多硫代谢物质流入VSC生成通路。综合通路富集分析与枢纽代谢物结果，研究认为硫代谢及其相关通路是M4阶段最重要的生物学过程，这与该组VSCs含量最高的结果一致。
图5.挥发性有机物（VOCs）共表达模块分析。（A）VOCs共表达模块的平均网络邻接聚类树状图；（B）模块-性状关联性分析；（C）各模块化合物类型及数量统计；（D）基于WCNA分析鉴定的各模块枢纽VOCs；（E）青色模块枢纽代谢物的相关性分析。
讨论与总结
香椿苗的挥发性和非挥发性代谢物随生长阶段显著变化，VSCs是香气的核心成分，萜类和特定酯类可平衡其气味。各阶段特征明确：M1具有草本香气和生物活性，M2感官品质优，M4硫代谢活跃、VSCs含量最高。研究为TSM的最佳收获期（如M2适合直接食用，M4适合作为风味增强剂）。与其它阶段相比，硫代谢在M4阶段是最为重要的生物学过程。这项全面分析揭示了TSM在其生长阶段的代谢变化和香气特征，为优化其栽培和利用提供了宝贵的见解。未来可结合基因表达分析，深入探究关键代谢物的合成机制。
参考文献：Zhang B, Zhai Y, Wu Z, et al. Dynamic characterization of volatile and non-volatile profiles during Toona sinensis microgreens growth in combination with chemometrics[J]. Food Research International, 2025, 206: 116013.